烟草丛顶病毒ORF3的克隆及原核表达

利用RT-PCR方法,自烟草丛顶病毒(Tobacco bush top virus,TBTV)龙陵分离物(TBTV-YLLi)的RNA中扩增出ORF3目的片段,并克隆到pMD18-T载体上进行序列分析.结果表明,TBTV-YLLi的ORF3全长714 bp,与TBTV其他分离物的核苷酸相似性和氨基酸相似性分别为98.3%～98.6%和95.4%～95.8%;与同属的花生丛簇病毒(Groundnut rosette virus,GRV)、豌豆耳突花叶病毒2号(Pea enation mosaic virus-2,PEMV-2)和胡萝卜拟斑驳病毒(Carrot mottle mimic virus,CMoMV)的核苷酸相似性分别为65.1%、61.6%和49.7%,氨基酸相似性分别为36.4%、34.6%和16.5%.将ORF3克隆到原核表达载体pET28a(+)上,获得的重组子pET28-ORF3转化大肠杆菌BL21-plysS,使用终浓度为1.0 mmol/L 的IPTG在37 ℃诱导培养4 h时,该融合蛋白表达量最高.融合蛋白经Ni~(2+)亲和柱层析纯化后,SDS-PAGE 电泳表明,融合蛋白相对分子质量约为35 000,与预计的相对分子质量大小相一致.